Biologia molekularna z elementami inżynierii genetycznej

Celem nauczania jest zaznajomienie studentów kierunku Biologia stosowana z najważniejszymi pojęciami biologii molekularnej dotyczącymi budowy i funkcji kwasów nukleinowych, procesów replikacji, transkrypcji i translacji oraz nowoczesnymi metodami i technikami inżynierii genetycznej: techniką klonowania genów do wektorów, metodami Southern blot, Northern blot i PCR. W ramach wykładów przedstawione zostaną zagadnienia związane z budową genomu, kontrolą ekspresji genów na poziomach: transkrypcyjnym, potranskrypcyjnym i translacyjnym. Omówione zostaną i zaprezentowane metody izolacji DNA i RNA oraz metody służące do oceny jakości kwasów nukleinowych.

Efekt kształcenia: rozumienie podstawowych mechanizmów molekularnych zachodzących w komórkach organizmów prokariotycznych i eukariotycznych oraz ich regulacji na poziomie DNA, RNA i białka; posługiwanie się podstawowymi technikami biologii molekularnej i inżynierii genetycznej

Wykłady (30 h):

1. Organizacja genomów organizmów prokariotycznych i eukariotycznych. Struktura DNA, zróżnicowanie budowy i funkcji RNA.

2. Genetyczne i fizyczne mapy genomów. Markery genetyczne i metody wykorzystanie w mapowaniu.

3. Sekwencjonowanie genomów. Metody sekwencjonowania DNA (terminacji łańcucha, chemicznej degradacji). Wykorzystanie strategii „shotgun” w sekwencjonowaniu genomów. Składanie poszczególnych fragmentów sekwencji DNA.

4. Proces replikacji DNA bakteryjnego i eukariotycznego. Mutacje i naprawa DNA. Mechanizmy rekombinacji DNA.

5. Lokalizowanie genów w sekwencjach DNA. Ustalenie funkcji genu (komputerowa analiza funkcji genu, analiza eksperymentalna, badania aktywności białka kodowanego przez nieznany gen).

6. Transkrypcja u Procaryota i Eucaryota. Budowa kompleksu inicjującego transkrypcję; etapy procesu transkrypcji. Synteza i dojrzewanie RNA bakteryjnego i eukariotycznego.

7. Translacja i jej regulacja (kod genetyczny). Zastosowanie biologii molekularnej w biologii i medycynie.

8. Co to jest inżynieria genetyczna ? Historia odkryć ważnych dla rozwoju inżynierii genetycznej. Właściwości kwasów nukleinowych; metody stosowane do rozdziału DNA i RNA.

9. Enzymy modyfikujące DNA i RNA (polimerazy, enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych, ligaza DNA)

10. Nukleazy; enzymy restrykcyjne, nazewnictwo, podział oraz zastosowanie w pracach laboratoryjnych.

11. Wektory plazmidowe, fagowe, kosmidowe i chromosomowe oraz ich zastosowanie w klonowaniu molekularnym.

12. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych; metody Southern blot, northern blot i slot-blot oraz ich zastosowanie w pracach laboratoryjnych.

13. Metoda PCR - odmiany oraz zastosowanie w biologii ,molekularnej i inżynierii genetycznej.

14. Analiza ekspresji genów metodą RT-PCR i Real-time PCR. Mikromacierze DNA. Zastosowanie metod inżynierii genetycznej w biologii i medycynie

Ćwiczenia laboratoryjne (30 h):

1. Metody izolacji DNA z komórek roślinnych i zwierzęcych; izolacja plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej. Elektroforeza izolatów w żelu agarozowym.

2. Analiza restrykcyjna plazmidowego DNA. Restrykcja DNA z wykorzystaniem różnych enzymów restrykcyjnych. Elektroforeza agarozowa uzyskanych fragmentów i analiza wzoru restrykcyjnego w odniesieniu do wzorca wielkości DNA.

3. Optymalizacja reakcji PCR. Określenie wpływu poszczególnych składników mieszaniny reakcyjnej, tj.: składu buforu reakcyjnego, stężenia jonów magnezu, dNTPs oraz ilości matrycy DNA na wydajność amplifikacji.

4. Oznaczanie płci człowieka przy użyciu PCR (wykorzystanie genu amylogeniny).

5. Izolacja całkowitego RNA z tkanek zwierzęcych. Ilościowa i jakościowa analiza RNA (pomiar spektrofotometryczny i elektroforeza).

6. Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT); analiza jakości cDNA; łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR). Elektroforeza, wizualizacja i analiza produktu PCR.

1. P.C. Turner i inni, „Biologia molekularna – krótkie wykłady”, PWN, 2011.

2. M. Bugno, H. Rokita, „Podstawowe techniki biologii molekularnej i biotechnologii”, , IBM UJ, Kraków 1999.

3. T.A. Brown, „Genomy” Red. Piotr Węgleński, PWN 2001.

4. D. P. Clark, “Molecular biology”, Elsevier, 2005.

5. B. Lewin, Genes V”, Oxford University Press, Oxford New York Tokyo, 1994.

6. J. Kur, „Podstawy inżynierii genetycznej”, Politechnika Gdańska, 1984 (skrypt).

7. J. Sambrook, E.F. Fritch i T. Maniatis, “Molecular cloning: a laboratory manual (Sec. Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.

8. A. Sechman, Molekularne mechanizmy determinacji płci u ptaków. Med. Wet., 61, 19-23, 2005.

9. . Z. Nowak, J. Gruszczyńska, „Wybrane techniki i metody analizy DNA”, Wydawnictwo SGGW, 2007.

Wiedza:

Student charakteryzuje podstawowe zagadnienia dotyczące budowy chemicznej kwasów nukleinowych oraz ich funkcji; opisuje strukturę genomów roślinnych i zwierzęcych; wyjaśnia znaczenie inżynierii genetycznej; charakteryzuje właściwości fizyczne i chemiczne kwasów nukleinowych oraz opisuje metody stosowane do ich rozdziału; wyjaśnia znaczenie genetycznych i fizycznych map genomów; opisuje metody stosowane w mapowaniu i sekwencjonowaniu genomów; wymienia i charakteryzuje najważniejsze grupy enzymów mających zastosowanie w inżynierii genetycznej; charakteryzuje podstawowe procesy zachodzące w komórce związane z funkcją kwasów nukleinowych;

zna metody stosowane do lokalizacji genów w sekwencjach DNA oraz molekularne metody analizy genów; opisuje podstawowe techniki inżynierii genetycznej stosowane do analizy DNA i RNA

definiuje podstawowe pojęcia proteomiki; opisuje metody stosowane w badaniach ekspresji genów na poziomie mRNA i białka; rozróżnia i opisuje poszczególne rodzaje wektorów wykorzystywanych w klonowaniu DNA; opisuje i objaśnia przebieg reakcji PCR i real-time PCR; opisuje metodę RT-PCR i qPCR.

Umiejętności:

Student: wykonuje izolację DNA z komórek roślinnych lub zwierzęcych; przeprowadza analizę elektroforetyczną DNA

przeprowadza analizę restrykcyjną plazmidowego DNA; na podstawie uzyskanych wyników opracowuje wzór restrykcyjny wektora plazmidowego; przeprowadza reakcję PCR; bada wpływ różnych czynników na przebieg tej reakcji; wykorzystuje technikę PCR do analizy DNA; potrafi oznaczać płeć człowieka stosując analizę PCR

przeprowadza izolację całkowitego RNA z tkanek zwierzęcych; ocenia jakość wyizolowanego RNA i wyznacza stężenie RNA w próbce;

stosuje technikę odwrotnej transkrypcji w celu uzyskania cDNA; bada ekspresję mRNA genu posługując się techniką RT-PCR.

Kompetencje społeczne:

Student: potrafi pracować w grupie i kierować małym zespołem wykonującym analizy laboratoryjne; wykazuje potrzebę aktualizowania wiedzy kierunkowej;

Test jednokrotnego wyboru. Aby uzyskać ocenę pozytywną student powinien mieć 55% poprawnych odpowiedzi.