Enzymologia

Celem przedmiotu jest przekazanie studentom podstawowych wiadomości dotyczących katalizy i biokatalizatorów ze szczególnym uwzględnieniem enzymów, abzymów, synzymów, ksenozymów i rybozymów. Omówiona zostanie struktura enzymów mono- i oligomerycznych oraz kompleksów wieloenzymowych, a także budowa i rola w katalizie koenzymów. Słuchacze zapoznają się z kinetyką jedno- i wielosubstratowych reakcji enzymatycznych oraz różnymi strategiami katalitycznymi realizowanymi przez enzymy. Omówiona zostanie ich specyficzność ale i promiskuityzm oraz możliwość wykorzystania w mediach niewodnych. Sporo uwagi zostanie poświęcone sposobom regulacji aktywności enzymów i ich roli w szlakach sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Celem ćwiczeń laboratoryjnych jest natomiast zapoznanie studentów z metodami oznaczania aktywności enzymów, wykreślaniem danych kinetyki enzymatycznej i wyznaczaniem typów inhibicji, oraz z podstawowymi zasadami obowiązującymi podczas izolacji enzymów i ich immobilizacji.

Wykłady:

- Kataliza homo-, hetero- i mikroheterogeniczna, typy katalizatorów nieorganicznych i organicznych i przyczyny ich różnej efektywności.Energia aktywacji (Ga) a szybkość reakcji. Budowa i zasady działania rybozymów, abzymów, synzymów i ksenozymów.

- Enzymy jako białka globularne (struktury I, II, III i IV rzędu). Budowa domenowa enzymów mono- i oligomerycznych, tworzenie kompleksów wieloenzymowych, struktura centrum aktywnego (aminokwasy kontaktowe i pomocnicze) i allosterycznego. Rola metali w strukturze i działaniu enzymów. Budowa i znaczenie koenzymów i grup prostetycznych w katalizie enzymatycznej. Rola witamin w strukturach koenzymów i grup prostetycznych. Sprzężenie koenzymatyczne.

- Specyficzność kierunkowa i substratowa enzymów oraz teorie oddziaływania enzym – substrat. Promiskuityzm katalityczny i substratowy enzymów. Molekularne mechanizmy katalizy enzymatycznej (kataliza kwasowo-zasadowa i kowalencyjna), istota aktywacji i teoria stanu przejściowego (tranzycji), efekty entropowe.

- Kinetyka hiperboliczna i sigmoidalna jedno- i wielosubstratowych reakcji enzymatycznych. Teorie Michaelisa-Menten i Briggsa-Haldane'a. Stałe kinetyczne reakcji. Typy inhibicji i inhibitorów, ich wpływ na przebieg reakcji enzymatycznej i wykorzystanie w nauce, medycynie i przemyśle. Kinetyka reakcji enzymatycznej w mediach niekonwencjonalnych (niewodnych). Kryteria doboru rozpuszczalników do biokatalizy i pojęcie warstwy wody niezbędnej. Jednostki aktywności enzymatycznej (U, Katal, aktywność właściwa i molekularna).

- Sposoby regulacji ilości (synteza i degradacja) enzymów - indukcja i represja syntezy enzymów (enzymy indukcyjne i konstytutywne), sposoby degradacji enzymów (enzymy krótko- i długożyjące). Regulacja aktywności enzymów - kontrola allosteryczna i przez sprzężenie zwrotne w szlakach prostych i rozgałęzionych (pojęcie i przykłady enzymów kluczowych), odwracalne modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, acetylacja, metylacja, ADP-rybozylacja), aktywacja przez ukierunkowaną proteolizę (zymogeny i zymogeniczność). Kierowanie i kompartmentacja enzymów.

- Klasyfikacja oraz nazewnictwo systematyczne i zwyczajowe enzymów.

- Techniki pozyskiwania i oczyszczania enzymów. Techniki immobilizacji enzymów. Zastosowanie enzymów w analityce biochemicznej i w modyfikacji składników żywności.

Ćwiczenia:

- Wyznaczanie krzywych progresji, vo i Vmax oraz badanie energii aktywacji (Ga) dla reakcji katalizowanej enzymatycznie

i nieenzymztycznie.

- Wpływ temperatury na przebieg reakcji katalizowanej enzymatycznie i kwasowo - wyznaczanie współczynnika Q10. Badanie termostabilności enzymów.

- Badanie powinowactwa enzymu do kilku różnych substratów.

- Badanie wpływu aktywatorów i inhibitorów na aktywność katalityczną enzymów. Sporządzanie wykresów kinetyki enzymatycznej (wybór odpowiedniej linearyzacji), wyznaczanie typów inhibicji oraz współczynnika IC50.

- Izolacja enzymów z materiału biologicznego, wyznaczanie aktywności właściwej otrzymanego preparatu, wyznaczanie wskaźnika oczyszczenia i wydajności ogólnej procesu. Immobilizacja otrzymanego enzymu i badanie jej efektywności

Literatura podstawowa:

1. Witwicki J., Ardelt W.: Elementy enzymologii. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1989.

2. Strumidło S., Tylicki A.: Enzymologia - podstawy. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2020.

3. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera. Wydawnictwo lekarskie PZWL 2004.

4. Webb E.C., (red): Enzyme nomenclature. Academic Press, Inc., 1992 i wznowienia, w tym dostępne internetowo https://iubmb.qmul.ac.uk/enzyme/

Literatura uzupełniajaca:

5. Bisswanger H.: Practical Enzymology. Wiley - VCH, 2019

6. Krauss G.: Biochemistry of signal transduction and regulation. Wiley VCH GmbH&Co. KGaA 2003.

Wiedza:

- Zna pojęcia katalizy i katalizatora, charakteryzuje typy katalizy i biokatalizatorów. Wie od czego zależy siła ich działania i specyficzność. Zna zasady klasyfikacji i nazewnictwa enzymów

- Zna budowę enzymów, rozumie kluczową rolę tych cząsteczek w regulacji metabolizmu komórki. Rozumie funkcjonowanie kompleksów wieloenzymowych. Zna budowę koenzymów i rolę witamin w ich strukturach

- Zna kinetykę reakcji enzymatycznej oraz mechanizmy działania inhibitorów i aktywatorów enzymów, potrafi wskazać ich zastosowania praktyczne. Zna różne strategie katalityczne realizowane przez enzymy

- Zna bierne i aktywne sposoby regulacji aktywności enzymów w komórkach. Potrafi wskazać ich znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania komórki

- Posiada wiedzę o procesach technologicznych wykorzystujących enzymy. Zna podstawowe metody immobilizacji enzymów i ich zastosowanie. Zna możliwości jakie stwarza stosowanie enzymów mediach niekonwencjonalnych

Umiejętności:

- Posługuje się poprawnie nomenklaturą enzymatyczną. Zapisuje równania reakcji enzymatycznych

- Ustala warunki oznaczania aktywności enzymów i wylicza dawki preparatów enzymatycznych optymalne dla danego procesu. Umie regulować szybkość przebiegu procesu enzymatycznego i przewidywać stopień konwersji substratu oraz ilość wytworzonego produktu

- Sporządza wykresy kinetyki enzymatycznej i wyznacza typy inhibicji. Wyznacza Ga, v0, kcat , IC50 i Q10.

- Potrafi izolować, oczyszczać i immobilizować enzymy. Wykazuje znajomość słabych i mocnych stron przyjętego rozwiązania biotechnologicznego

Kompetencje społeczne:

- Potrafi organizować warsztat pracy, pracować w grupie i kierować małym zespołem. Umie zarządzać czasem

- Ma świadomość zagrożeń wynikających z niezgodnej z zasadami BHP pracy w laboratorium potrafi prawidłowo określić priorytety służące realizacji określonego celu

- Jest świadom możliwości ale i zagrożeń związanych z doskonaleniem technik pozyskiwania enzymów i ich masowym wykorzystaniem

- Rozumie zalety wykorzystania „zielonej chemii” w przemyśle

Warunkiem zaliczenia przedmiotu jest aktywne uczestnictwo w ćwiczeniach laboratoryjnych oraz wykazanie się wiedzą z zakresu ćwiczeń (rozwiązanie zadania problemowego i wykonanie zadania obliczeniowego) i wykładów podczas kończącego kurs egzaminu pisemnego. Udział oceny z zaliczenia wykładów w ocenie końcowej wynosi 70%, z zaliczenia ćwiczeń 30 %.

Na ocenę bardzo dobrą student:

Bezbłędnie posługuje się pojęciami z zakresu katalizy i katalizatorów. Bardzo dobrze zna zasady budowy enzymów, abzymów, synzymów i rybozymów. Wskazuje i definiuje domeny białkowe odpowiedzialne za katalizę, regulację aktywności i kooperację z innymi składnikami komórki. Bardzo dobrze rozumie różnice w specyficzności katalizatorów, wie co z nich wynika i jak można je modyfikować. Wskazuje przyczyny różnic w kinetyce działania enzymów oraz wpływ na to działanie inhibitorów i aktywatorów (zna zapis matematyczny). Zna zasady kierowania enzymów do poszczególnych przedziałów komórkowych, szeroko opisuje sposoby regulacji ilości i aktywności enzymów i wie jakie może to mieć znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania organizmu. Posiada wiedzę o procesach technologicznych wykorzystujących enzymy. Z łatwością wskazuje ich słabe i mocne strony.

Zna i stosuje nomenklaturę enzymatyczną, potrafi na podstawie nazwy enzymu wskazać katalizowaną przez niego reakcję i prawidłowo ją zapisać. Rozumie wpływ różnych czynników na przebieg katalizy i potrafi to wykorzystać w praktyce. Bezbłędnie oblicza aktywności, wyznacza typy inhibicji i ustala dawki enzymów odpowiednie dla danych procesów. Zna zasady izolacji, oczyszczania i immobilizacji enzymów i potrafi je wykorzystać. Bezbłędnie wskazuje słabe i mocne strony przyjętego rozwiązania technologicznego.

Na ocenę dostateczną student:

Zna podstawowe pojęcia z zakresu katalizy i biokatalizatorów. Zna zasady klasyfikacji i nazewnictwa enzymów. Ma podstawową wiedzę na temat budowy enzymów i rybozymów. Potrafi podać proste przykłady wskazujące na ich specyficzność. Zna wzory podstawowych koenzymów i wskazuje enzymy z którymi mogą współdziałać. Dostrzega różnice pomiędzy hiperboliczną i sigmoidalną kinetyką działania enzymów. Wie jaki wpływ na działanie enzymów mogą mieć zmiany środowiska reakcji (temp., pH, aw itp.). Rozróżnia typy inhibicji. Zna podstawowe sposoby regulacji ilości i aktywności enzymów i wie jakie może to mieć znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania organizmu.

Zna zasady klasyfikacji enzymów ale nie potrafi ich wykorzystywać. Z błędami zapisuje równania reakcji enzymatycznych. Zna zasady analizy enzymatycznej i izolacji enzymów ale nie rozumie co wynika z nich w praktyce. Oblicza aktywności, dawki enzymów itp. ale ze znaczącymi błędami. Zna teorie dotyczące kinetyki reakcji enzymatycznej ale nie do końca potrafi wykorzystać je w praktyce.