Inżynieria genetyczna

Podczas wykładów przedstawione zostaną podstawy biochemiczne manipulacji genetycznych oraz ich specyfika w odniesieniu do komórek bakteryjnych i roślinnych. Oddzielny blok wykładów poświęcony jest różnym strategiom i metodom klonowania molekularnego w zależności od charakteru i wyjściowej informacji na temat docelowej sekwencji. Kolejny blok tematyczny dotyczy charakterystyki klonów rekombinantowych ze szczególnym uwzględnieniem alternatywnych metod sekwencjonowania, analizy ekspresji na poziomie RNA oraz analizy oddziaływań międzycząsteczkowych.

W czasie ćwiczeń studenci wykonują pełny zakres czynności związanych ze standardowym klonowaniem w komórkach Escherichia coli: Obejmuje on najpierw przygotowanie komórek kompetentnych oraz DNA wektora (plazmidu) i DNA klonowanego. Następnie studenci przeprowadzają ligację i transformację bakterii, po której zapoznają się praktycznie z różnymi metodami selekcji klonów rekombinantowych.

Wykłady

Zakres i podstawowe pojęcia inżynierii genetycznej.

Enzymy wykorzystywane do manipulacji genetycznych.

Manipulacje biochemiczne cząsteczek DNA w toku klonowania molekularnego.

Klonowanie w Escherichia coli.

Inżynieria genetyczna komórek roślinnych.

Strategie klonowania molekularnego.

Metody selekcji klonów rekombinantowych.

Zastosowanie metody PCR do izolacji nowych genów.

Identyfikacja i klonowanie genów o zróżnicowanej ekspresji.

Metody izolacji genów o określonej funkcji.

Charakterystyka klonów rekombinatowych – techniki sekwencjonowania DNA i mapowanie transkrypcyjne.

Charakterystyka klonów rekombinatowych – analiza interakcji białko – białko oraz białko – kwas nukleinowy.

Mutageneza in vitro klonowanych genów.

Produkcja białek rekombinantowych.

Perspektywy technologii zrekombinowanego DNA.

Społeczna percepcja manipulacji genetycznych.

Ćwiczenia

Produkcja kompetentnych komórek Escherichia coli. Kontrola kompetencji otrzymanych komórek poprzez transformację plazmidowym DNA.

Izolacja DNA wektora plazmidowego. Izolacja klonowanego DNA. Kontrolna elektroforeza wyizolowanych preparatów DNA. Trawienie DNA wektora i klonowanego DNA enzymem restrykcyjnym.

Kontrolna elektroforeza strawionych preparatów DNA. Defosforylacja wektora. Preparatywna elektroforeza DNA wektora – izolacja formy liniowej z żelu. Ligacja wektora z klonowanym DNA.

Przygotowanie stałych i płynnych podłoży do hodowli bakterii. Transformacja mieszaniny ligacyjnej i kontrolnych preparatów DNA do komórek Escherichia coli.

Minipreparatyka plazmidowego DNA klonów rekombinantowych. PCR kolonijny. Przeniesienie kolonii z szalek na błony nylonowe. Hybrydyzacja kolonijna z sondą DNA.

Przygotowanie reakcji sekwencjonowania DNA. Rozdział produktów w sekwenatorze automatycznym. Analiza chromatogramów sekwencyjnych.

1) Old R., Primrose S. (1995) Principles of Gene Manipulation. 5th Ed. Blackwell Scientific Publications

2) Brown T. A. (2009) Genomy. Wyd. 2. Wydawnictwo Naukowe PWN

3) Brown T. A. (2010) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 6th Ed. Wiley-Blackwell

4) Primrose S. B., Twyman R. M. (2006) Principles of Genome Analysis and Genomics. 7th Ed. Blackwell Publishing

5) Sambrook J., Russell D.W. (2001) Molecular cloning – a laboratory manual. 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press

Wiedza

Definiuje podstawowe pojęcia inżynierii genetycznej.

Charakteryzuje manipulacje biochemiczne cząsteczek DNA i wykorzystywane do tego enzymy.

Opisuje klonowanie molekularne w komórkach bakteryjnych i manipulacje genetyczne komórek roślinnych.

Identyfikuje poszczególne strategie klonowania molekularnego.

Tłumaczy metody selekcji i charakterystyki klonów rekombinantowych.

Opisuje klonowanie różnego typu sekwencji DNA.

Objaśnia zagadnienia mutagenezy in vitro i produkcji białek rekombinantowych.

Wskazuje perspektywy technologii zrekombinowanego DNA i związane z nimi obawy społeczne.

Umiejętności

Przygotowuje komórki kompetentne i ocenia ich jakość.

Wykonuje klonowanie molekularne w wektorze plazmidowym.

Kontroluje klony rekombinantowe przy użyciu PCR i hybrydyzacji kolonijnej.

Przeprowadza sekwencjonowanie DNA oraz interpretuje jego wyniki.

Obsługuje urządzenia laboratoryjne - wirówki, spektrofotometry, aparaty do elektroforezy i dokumentacji rozdziałów, termocyklery, inkubatory i sekwenator DNA.

Kompetencje społeczne

Posiada zdolność do pracy w zespole.

Wykazuje świadomość w zakresie zagrożeń związanych z technologią zrekombinowanego DNA.

Wykazuje uwrażliwienie na znaczenie społecznej percepcji manipulacji genetycznych.

Wykłady - test wielokrotnego wyboru

Ćwiczenia - sprawdzian wiedzy

Kryteria - osiągnięcie zamierzonych efektów kształcenia

brak