Analiza proteomu

Przedmiot kierunkowy - obowiązkowy, 1 semestr studiów

Wymagania wstępne: zaliczone przedmioty z zakresu biologii komórki, biochemii, biofizyki, chemii ogólnej i organicznej, wskazane odbycie kursu z wprowadzenia do proteomiki (np. Podstawy proteomiki)

Tematyka zajęć:

Wykłady 15 godz.

1. Wprowadzenie do tematyki przedmiotu: definicja proteomiki i zakres merytoryczny, omówienie podejść badawczych i podstawowych schematów w analizie proteomu - „bottom-up” z zastosowaniem analizy MudPIT – Multidimensional Protein Identification Technology oraz „top-down”.

2. Charakterystyka podstawowych metod i technik badawczych w proteomice: elektroforeza, spektrometria masowa MS, podstawy frakcjonowania oraz zarys problematyki badań strukturalnych i funkcjonalnych białek.

3. Elektroforeza dwukierunkowa (2DE) w mapowaniu proteomu: techniki otrzymywania homogenatu białkowego przygotowania prób, wstępne frakcjonowanie, rehydratacja i ekwilibracja pasków IPG, praktyczne aspekty związane ze specyficznymi wymaganiami zmian warunków eksperymentalnych przy przejściu z kierunku I (IEF) do II (SDS-PAGE). Problemy badawcze (powtarzalność i artefakty), potencjał analityczny, ograniczenia (troubleshooting), kierunki rozwoju i doskonalenia.

4. 2DE: przykłady metod optymalizacyjnych, standaryzacja procedur - użycie zestawów analitycznych (kits), sposoby analizy danych, metody porównawczej analizy żeli (matching),podstawowe stosowane narzędzia bioinformatyczne, przykłady i zastosowanie zaawansowanych technik 2DE analizy proteomów: DIGE (Difference In-Gel Electrophoresis), BN (Blue-Native)/SDS-PAGE, nowe koncepcje poprawy rozdzielczości i czułości - paski typu narrow-range pH, żele typu ultrazoom, optymalizacja barwienia w SDS-PAGE.

5. Identyfikacja białek w proteomice analitycznej: (1) metody analizy bezpośredniej z zastosowaniem mikromacierzy białkowych (protein chips, microarrays, mikromacierze odwróconej fazy, SELDI - Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization), (2) analiza elektroforegramów 2-DE - katalogizacja proteomów i tworzenie map białkowych 2DE, (3) analiza odcisku palca mapy peptydowej, PMF (Peptide Mass Fingerprinting,) w badaniach MS, (4) sekwencjonowanie de novo na podstawie wyników MS.

6. Alternatywne schematy postępowania w proteomice porównawczej i funkcjonalnej, wraz z najnowocześniejszymi strategiami i metodami badawczymi: LC-MS, 2D-LC-MS, CE-MS, sposoby znakowania populacji białkowych w różnicowej analizie ekspresji białek: (a) metaboliczne (in vivo- SILAC, Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Cell Culture), (b) chemiczne (ICAT, Isotope-Coded Affinity Tag, iTRAQ, isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification), (c) znakowanie enzymatyczne (in vivo-18O).

7. Przykłady zastosowań analizy proteomu: fosfoproteomika i detekcja zmian posttranslacyjnych w białkach, subproteomika i analizy proteomów organelli; metaproteomika – analiza proteomów konsorcjów drobnoustrojów, proteomika w technologii żywności, proteomika kliniczna (LCM, laser tissue microdissection, techniki whole body array), farmakoproteomika, proteomika roślin.

Ćwiczenia laboratoryjne 30 godz.

1. Elementy funkcjonalnej analizy proteomu: regulacja enzymatycznego szlaku metylotroficznego drożdży – zjawisko indukcji genów i represji katabolicznej (glukozowej), pośrednie obserwacje aktywności dehydrogenaz: formaldehydowej i mrówczanowej oraz oksydazy alkoholowej w kontekście wzrostu w obecności metanolu i aktywności biodegradacji formaldehydu.

2. Analizy funkcjonalne białek enzymatycznych: oznaczenia zymograficzne aktywności kluczowych enzymów szlaku metylotroficznego drożdży: dehydrogenazy formaldehydowej i oksydazy alkoholowej.

3. Porównawcza proteomika ekspresji białek: mapowanie proteomu drożdży metylotroficznych metodą elektroforezy 2-DE. Porównanie profili białkowych drożdży hodowanych w warunkach represji oraz indukcji enzymów szlaku C1

Podstawowa:

Kraj, A., Silberring J., red. Proteomika. Praca zbiorowa, Wyd.Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego, 2004

Kraj, A., Drabik A., Silberring J. (red. nauk.) Proteomika i metabolomika. Praca zbiorowa, Wyd. Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa 2010

Bodzon-Kulakowska A., Bierczynska-Krzysik A., Dylag T., Drabik A., Suder P., Noga M., Jarzebinska J., Silberring J. Methods for samples preparation in proteomic research (2007) Journal of Chromatography B 849: 1-31.

Uzupełniająca:

Canas B., Pineiro C., Calvo E., Lopez-Ferrer D., Gallardo J.M. (2007) Trends in sample preparation for classical and second generation proteomics. Journal of Chromatography A 1153: 235-258.

Rose J.K.C., Bashir S., Giovannoni J.J., Jahn M.M., Saravanan R.S. (2004) Tackling the plant proteome: practical approaches, hurdles and experimental tools. The Plant Journal 39: 715-733.

Westermeier R. Naven T. Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis. John Wiley & Sons, 2002.

Wiedza - student zna i rozumie:

- zakres merytoryczny i metodyczny proteomiki w odniesieniu do mapowania białek oraz analizy funkcjonalnej proteomu

- podstawowe podejścia badawcze w analizie proteomu: „bottom-up” oraz „top down”

- główne metody i techniki badawcze (tools of proteomics) wykorzystywane w analizie proteomu

- podstawy teoretyczne, stosowalność i potencjał analityczny elektroforezy dwukierunkowej (2DE) w mapowaniu proteomu, problemy i ograniczenia badawcze, sposoby analizy danych, metody porównawczej analizy żeli (matching) oraz podstawowe stosowane narzędzia bioinformatyczne

- podstawowe zabiegi optymalizacyjne i działania standaryzacyjne rozdziałów elektroforetycznych 2DE oraz kierunki rozwoju i doskonalenia metody 2DE

- praktyczne aspekty związane ze specyficznymi wymaganiami zmian warunków eksperymentalnych przy przejściu z kierunku I (IEF) do II (SDS-PAGE)

- wybrane przykłady i zastosowanie zaawansowanych technik 2DE w analizie proteomu: DIGE (Difference In-Gel Electrophoresis), BN (Blue-Native)/SDS-PAGE, pasków IPG typu narrow-range pH, żeli typu ultrazoom, nowoczesnych technik barwienia w SDS-PAGE.

- sposoby identyfikacji białek w proteomice analitycznej: metody analizy bezpośredniej z zastosowaniem mikromacierzy białkowych, katalogizację proteomów i tworzenie map białkowych 2DE, analizy identyfikacyjne w oparciu o wyniki spektrometrii masowej (MS): metodę odcisku palca mapy peptydowej (PMF, Peptide Mass Fingerprinting) i sekwencjonowanie de novo.

- alternatywne metody, schematy i nowoczesne strategie postępowania w proteomice porównawczej i funkcjonalnej: LC-MS, 2D-LC-MS, CE-MS, sposoby znakowania populacji białkowych w różnicowej analizie ekspresji białek (metaboliczne, chemiczne, enzymatyczne).

- badania z zakresu proteomiki klinicznej, fosfoproteomiki i detekcji zmian posttranslacyjnych w białkach, subproteomiki, metaproteomiki, farmakoproteomiki, proteomiki w technologii żywności.

- możliwości wykorzystania proteomiki, wspierając swoją wiedzę konkretnymi przykładami analizy proteomu: roślinnego, ludzkiego, drobnoustrojów, organelli komórkowych.

Umiejętności - student potrafi:

- stosować wybrane metody pozyskania z materiału biologicznego ekstraktów zawierających natywne białka proteomu

- przygotować i przeprowadzić rozdział elektroforetyczny techniką elektroforezy dwukierunkowej oraz wykonać porównawczą analizę uzyskanych map białkowych z różnych próbek biologicznych

- przygotować i przeprowadzić rozdział elektroforetyczny techniką elektroforezy w warunkach natywnych oraz dokonać analizy zymograficznej

- pracować z nowoczesną aparaturą i sprzętem laboratoryjnym wykorzystywanym w analizie funkcjonalnej białek komórkowych

- wykorzystywać specjalistyczne oprogramowanie do kontroli aparatury badawczej oraz do analizy wyników

- zaplanować eksperyment naukowy oraz dobrać optymalną strategię badawczą w badaniach proteomu

- dokonać krytycznej analizy i systematycznego opracowania wyników oraz eliminacji artefaktów w analizie proteomicznej

Kompetencje społeczne - student jest gotów do:

- podjęcia zorganizowanej pracy w zespole badawczym

- wykorzystania najnowszych osiągnięć badań naukowych w praktyce analizy proteomu

- wykorzystania najnowszych osiągnięć badań naukowych w praktyce analizy proteomu

- promowania wartości cechujących dobrego pracownika laboratorium: dyscypliny, odpowiedzialności, rzetelności, systematyczności, odporności na niepowodzenia

- wykonywania pracy, podporządkowując działania i wysiłki na rzecz realizacji zakreślonego schematu badawczego z jednoczesną potrzebą wykazania inwencji i kreatywności w celu rozwiązywania konkretnych zadań praktycznych

Wykłady: Egzamin pisemny ograniczony czasowo, obejmujący test jednokrotnego/wielokrotnego wyboru oraz rozwiązanie zadania problemowego - analiza zadanego przypadku (70% udziału w ocenie końcowej)

Ćwiczenia: Zaliczenie raportu/sprawozdania z prac laboratoryjnych (grupowe) (30%)