Analiza proteomu

Przedmiot przewidziany jest jako kontynuacja i rozwinięcie kursu „Podstawy proteomiki” realizowanego na III roku studiów I stopnia kierunku: biotechnologia. Celem kursu jest zapoznanie studentów z metodami mapowania i identyfikacji białek stosowanych w analizie proteomicznej, poznanie różnych, alternatywnych schematów postępowania podczas tej analizy, jak również zaznajomienie się z nowymi kierunkami rozwoju proteomiki oraz z konkretnymi przykładami analizy proteomu w badaniach o charakterze poznawczym i aplikacyjnym. Ćwiczenia laboratoryjne obejmują mapowanie białek metodą dwukierunkowej elektroforezy oraz elementy analizy funkcjonalnej proteomu: zymografię enzymów indukowanych stresem komórkowym, a także wstępne obserwacje mechanizmów regulacji wybranych szlaków metabolicznych. Podczas modułów ćwiczeniowych realizowany jest szczegółowo ustalony z każdą z grup, konkretny projekt badawczy.

Wykłady

Treść wykładów wprowadzających do przedmiotu obejmuje: definicję proteomiki oraz określenie zakresu merytorycznego tej dziedziny badawczej, omówienie podstawowych elementów analizy proteomicznej, stosowanych metod i technik badawczych (elektroforeza, spektrometria masowa, podstawy frakcjonowania i zarys problematyki badań strukturalnych białek).

W dalszej części kursu przedstawione są bardziej szczegółowo teoretyczne podstawy oraz podane przykłady zastosowań metod stosowanych w proteomice funkcjonalnej, obejmującej analizę struktury, dynamiki molekularnej oraz funkcji białek: dyfrakcji promieniowania X, spektroskopii fluorescencyjnej, ramanowskiej, dychroizmu kołowego oraz magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), a ponadto metod radioizotopowych i immunoprecypitacyjnych, a także modelowania komputerowego.

Omówione są metody oczyszczania białek oraz sposoby ich identyfikacji (chromatograficzne i elektroforetyczne), a także chemiczne i enzymatyczne techniki fragmentacji białek, otrzymywanie map peptydowych oraz podstawy analizy składu i sekwencji aminokwasowej w łańcuchu polipeptydowym.

Wyjaśnienie podstaw analizy proteomicznej poparte jest konkretnymi przykładami zatosowań w kontekście najdynamiczniej rozwijanych dziedzin: proteomiki klinicznej (diagnostyka chorób nowotworowych, badania schorzeń centralnego układu nerwowego, medycyna molekularna), proteomiki roślin i mikroorganizmów, farmakoproteomiki, jak również badań zależności i interakcji między białkami proteomu oraz mapowania modyfikacji posttranslacyjnych białek, w tym zwłaszcza glikoprotein.

Studenci zapoznają się z zasadami konstrukcji peptydowych i białkowych baz danych oraz z podstawami korzystania z bioinformatycznych narzędzi definiowania proteomów. Przedyskutowane zostaną nowe kierunki rozwoju proteomiki, takie jak analizy proteomów komórkowych i subkomórkowych, metody inżynierii białkowej, a także koncepcje wytwarzania oraz przykłady użycia zintegrowanych mikroukładów analitycznych, mikromacierzy białkowych oraz innych rozwiązań, powstających w oparciu o osiągnięcia nanobiotechnologii.

Ćwiczenia

W trakcie cyklu ćwiczeń studenci wykonają doświadczenia nad modulacją metabolizmu związków jednowęglowych oraz węglowodorów alifatycznych przez mikroorganizmy eukariotyczne, z wykorzystaniem odpowiednio dobranych induktorów ekspresji genów, a także substratów wywołujących zjawisko represji katabolicznej. Jako materiał biologiczny wykorzystane zostaną wyizolowane ze środowiska drożdże rodzaju Candida, Hansenula oraz Trichosporon. Aktywność metaboliczna będzie obserwowana za pomocą mikrobiorekatorów, umożliwiających ciągły i zautomatyzowany pomiar wybranych parametrów procesowych, takich jak konsumpcja tlenu, zmiany pH w podłożu, zmiany przewodnictwa. Białkowe ekstrakty komórkowe otrzymane z hodowli drożdży zostaną poddane rozdziałom elektroforetycznym metodą dwukierunkowej elektroforezy (zestaw MiniProtean III, BioRad), jak również frakcjonowaniu techniką cieczowej chromatografii FPLC (zestaw BioLogic, BioRad). Wstępna analiza proteomiczna polegać będzie na porównaniu map białkowych uzyskanych z hodowli prowadzonych w różnych warunkach środowiskowych. Jednocześnie, w poszczególnych frakcjach eluatu po rozdziale chromatograficznym dokonane zostaną obserwacje aktywności wybranych enzymów uczestniczących w przemianach ksenobiotyków. Analizy enzymatyczne prowadzone będą w ujęciu kinetycznym metodą zatrzymanego przepływu za pomocą urządzenia typu stopped-flow apparatus (Applied Instruments), sprzęgniętego ze spektrofotometrem UV-VIS Jasco V-530.

Podstawowa

1. Kraj, A., Silberring J., red. Proteomika. Praca zbiorowa, Wyd.Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego, 2004

2. Kraj, A., Drabik A., Silberring J. (red. nauk.) Proteomika i metabolomika. Praca zbiorowa, Wyd. Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa 2010

3. Bodzon-Kulakowska A., Bierczynska-Krzysik A., Dylag T., Drabik A., Suder P., Noga M., Jarzebinska J., Silberring J. Methods for samples preparation in proteomic research (2007) Journal of Chromatography B 849: 1-31.

Uzupełniająca

1. Canas B., Pineiro C., Calvo E., Lopez-Ferrer D., Gallardo J.M. (2007) Trends in sample preparation for classical and second generation proteomics. Journal of Chromatography A 1153: 235-258.

2. Rose J.K.C., Bashir S., Giovannoni J.J., Jahn M.M., Saravanan R.S. (2004) Tackling the plant proteome: practical approaches, hurdles and experimental tools. The Plant Journal 39: 715-733.

3. Westermeier R. Naven T. Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis. John Wiley & Sons, 2002.

WIEDZA - absolwent zna i rozumie:

zakres merytoryczny i metodyczny proteomiki w odniesieniu do mapowania białek oraz analizy funkcjonalnej proteomu

podstawowe podejścia badawcze w analizie proteomu: „bottom-up” oraz „top down”

główne metody i techniki badawcze (tools of proteomics) wykorzystywane w analizie proteomu

podstawy teoretyczne, stosowalność i potencjał analityczny elektroforezy dwukierunkowej (2DE) w mapowaniu proteomu, problemy i ograniczenia badawcze, sposoby analizy danych, metody porównawczej analizy żeli (matching) oraz podstawowe stosowane narzędzia bioinformatyczne

podstawowe zabiegi optymalizacyjne i działania standaryzacyjne rozdziałów elektroforetycznych 2DE oraz kierunki rozwoju i doskonalenia metody 2DE

praktyczne aspekty związane ze specyficznymi wymaganiami zmian warunków eksperymentalnych przy przejściu z kierunku I (IEF) do II (SDS-PAGE)

wybrane przykłady i zastosowanie zaawansowanych technik 2DE w analizie proteomu: DIGE (Difference In-Gel Electrophoresis), BN (Blue-Native)/SDS-PAGE, pasków IPG typu narrow-range pH, żeli typu ultrazoom, nowoczesnych technik barwienia w SDS-PAGE.

sposoby identyfikacji białek w proteomice analitycznej: metody analizy bezpośredniej z zastosowaniem mikromacierzy białkowych, katalogizację proteomów i tworzenie map białkowych 2DE, analizy identyfikacyjne w oparciu o wyniki spektrometrii masowej (MS): metodę odcisku palca mapy peptydowej (PMF, Peptide Mass Fingerprinting) i sekwencjonowanie de novo.

alternatywne metody, schematy i nowoczesne strategie postępowania w proteomice porównawczej i funkcjonalnej: LC-MS, 2D-LC-MS, CE-MS, sposoby znakowania populacji białkowych w różnicowej analizie ekspresji białek (metaboliczne, chemiczne, enzymatyczne).

badania z zakresu proteomiki klinicznej, fosfoproteomiki i detekcji zmian posttranslacyjnych w białkach, subproteomiki, metaproteomiki, farmakoproteomiki, proteomiki w technologii żywności.

możliwości wykorzystania proteomiki, wspierając swoją wiedzę konkretnymi przykładami analizy proteomu: roślinnego, ludzkiego, drobnoustrojów, organelli komórkowych.

UMIEJĘTNOŚCI - absolwent potrafi:

stosować wybrane metody pozyskania z materiału biologicznego ekstraktów zawierających natywne białka proteomu

przygotować i przeprowadzić rozdział elektroforetyczny techniką elektroforezy dwukierunkowej oraz wykonać porównawczą analizę uzyskanych map białkowych z różnych próbek biologicznych

przygotować i przeprowadzić rozdział elektroforetyczny techniką elektroforezy w warunkach natywnych oraz dokonać analizy zymograficznej

pracować z nowoczesną aparaturą i sprzętem laboratoryjnym wykorzystywanym w analizie funkcjonalnej białek komórkowych

wykorzystywać specjalistyczne oprogramowanie do kontroli aparatury badawczej oraz do analizy wyników

zaplanować eksperyment naukowy oraz dobrać optymalną strategię badawczą w badaniach proteomu

dokonać krytycznej analizy i systematycznego opracowania wyników oraz eliminacji artefaktów w analizie proteomicznej

KOMPETENCJE SPOŁECZNE - absolwent jest gotów do:

podjęcia zorganizowanej pracy w zespole badawczym

wykorzystania najnowszych osiągnięć badań naukowych w praktyce analizy proteomu

właściwej oceny ryzyka oraz analizy efektów pracy laboratoryjnej

promowania wartości cechujących dobrego pracownika laboratorium: dyscypliny, odpowiedzialności, rzetelności, systematyczności, odporności na niepowodzenia

wykonywania pracy, podporządkowując działania i wysiłki na rzecz realizacji zakreślonego schematu badawczego z jednoczesną potrzebą wykazania inwencji i kreatywności w celu rozwiązywania konkretnych zadań praktycznych

Egzamin pisemny ograniczony czasowo, obejmujący test jednokrotnego/wielokrotnego wyboru oraz rozwiązanie zadania problemowego - analiza zadanego przypadku, udział oceny z zaliczenia wykładów w ocenie końcowej wynosi 70%

Zaliczenie raportu/sprawozdania z prac laboratoryjnych (grupowe), udział oceny z zaliczenia ćwiczeń w ocenie końcowej wynosi 30%